Preparación y caracterización de derivados insolubilizados de la enzima L-arabinosa isomerasa para su empleo en la bioconversión de D-galactosa en D-tagatosa

Abstract

La D-tagatosa es un azúcar raro, enantiómero de la D-fructosa, que puede obtenerse por isomerización de la D-galactosa. Su gran interés tecnológico reside no sólo en su capacidad endulzante (similar a la sacarosa) y en sus numerosas propiedades funcionales (agente utilizado para el tratamiento de la diabetes tipo II y en el control de la obesidad), sino también que su obtención puede lograrse aprovechando la D-lactosa contenida en los efluentes de la industria láctea. De esta forma, en este trabajo de Tesis, ha sido descripto el proceso de obtención del mencionado nutraceútico empleando la vía de síntesis biológica mediante la utilización de la enzima L-arabinosa isomerasa (EC 5.3.1.4) aislada de Enterococcus faecium DBFIQ E36. La actividad enzimática producida por dicho organismo, a través de la composición del medio de cultivo de crecimiento, fue optimizada mediante un diseño de arreglos ortogonales. A continuación, los extractos enzimáticos libre de células fueron obtenidos y purificados hasta homogeneidad electroforética. Seguidamente, la enzima fue caracterizada exhaustivamente, mostrando parámetros cinéticos, de estabilidad térmica y frente al pH, tecnológicamente relevantes. Luego, las preparaciones purificadas fueron inmovilizadas tanto en soportes comerciales como en derivados de quitosano sintetizados para inmovilizar metaloenzimas, empleando la técnica de inmovilización multipuntual por enlaces covalentes utilizando glicidol, epiclorhidrina y glutaraldehído como agentes activantes, obteniéndose biocatalizadores de alta actividad equivalente y específica. Finalmente, los resultados obtenidos a lo largo del desarrollo de esta Tesis, han revelado la viabilidad tecnológica de este proceso de bioconversión enzimático, presentando una potencial aplicabilidad comercial.

D-tagatose is a rare sugar, enantiomer of D-fructose, which can be obtained by D-galactose isomerization. Their great technological interest lies not only in their ability as a bulking sweetener (like sucrose) and their many functional properties (substance used for treatment of type II diabetes and obesity control) but also because their recovery can be achieved by taking advantage of D-lactose contained in dairy industries effluents. In that way, in this doctoral Thesis work, has been described the process for obtaining the previously mentioned nutraceutical molecule by employing the biological synthetic pathway through the use of the enzyme L-arabinose isomerase (EC 5.3.1.4) isolated from Enterococcus faecium DBFIQ E36. The enzymatic activity produced by the cited organism, through the composition of the growth medium, was optimized by using an orthogonal array design. Furthermore, cell-free enzyme extracts were obtained and purified to electrophoretic homogeneity in order to achieve pure preparations of L-arabinose isomerase. Then, the enzyme was thoroughly characterized, showing technologically relevant properties such as kinetic parameters, thermal stability and stability to pH. In addition, enzyme purified preparations were immobilized either on commercial supports or synthesized chitosan derivatives adapted to immobilize metalloenzymes by using the multipoint covalent attachment approach with glycidol, epichlorohydrin and glutaraldehyde as activating agents. The biocatalysts obtained, have shown high equivalent and specific activities. Finally, the results attained through the development of this doctoral Thesis work, have revealed that the enzymatic bioconversion process is technologically feasible arising a potential commercial applicability.