Desarrollo y evaluación de PCRs Multiplex para la tipificación de Leptospira spp.

Abstract

La leptospirosis es una zoonosis bacteriana que afecta a un millón de personas y mata a 58.900 cada año. Hay fuertes evidencias que sugieren que esta alta carga aumentará aún más en el futuro, como consecuencia del cambio climático. La identificación de las variedades de Leptospira spp. circulantes permite comprender la epidemiología de la enfermedad, mejorar su vigilancia y evaluar la utilidad de los métodos diagnósticos y de las vacunas disponibles para humanos y animales Hay pocos métodos de tipificación y no sólo son complejos, sino que la mayoría requieren del aislamiento de la cepa de leptospira. Se propone desarrollar dos técnicas de amplificación múltiple del gen 16SARNr (mediante PCR convencional y Real Time) para la diferenciación de los tres grupos de especies de Leptospira spp. (patógenas, intermedias y saprófitas). Con la aplicación de estas técnicas se espera aumentar el éxito de tipificación de las muestras estudiadas, reducir el número de reacciones de amplificación, diferenciar la especie de Leptospira spp. en patógena, intermedia y saprófita solo mediante una reacción sin necesidad de secuenciación; evitando este costoso paso previo en el caso de las especies patógenas y aumentar la accesibilidad de la tipificación por reducción de costos y complejidad aún en relación a la mejor metodología disponible y aplicada actualmente. Todo esto, permitiría aumentar la información disponible de las especies circulantes en Argentina a menor costo, y con una tecnología más simple y accesible, con menor consumo de tiempo, trabajo y menor demora en la obtención del resultado. Luego de desarrolladas estas dos PCRs se determinará la especificidad y sensibilidad analítica de las técnicas desarrolladas, mediante la utilización de cepas de referencia y un panel de sueros y/ sangre entera de pacientes de Argentina con leptospirosis confirmada y descartada, se comprarán finalmente los éxitos de tipificación de cada una.

Leptospirosis is a bacterial zoonosis that affects one million people and kills 58,900 every year. There is strong evidence that may will increase further in the future, as a result of climate change. The identification of types of circulating leptospires may be useful for the understanding of the disease epidemiology, improve its surveillance and to know the usefulness of diagnostic methods and vaccines available for humans and animals. There are only few methods of typing and they are not only very complex, but most of them required the isolation of Leptospira strains. It is proposed to develop two multiple amplification techniques of the 16SARNr gene (by means of conventional and real-time PCR) for the differentiation of the three groups of Leptospira spp. (pathogens, intermediates and saprophytes). With the application of these techniques it is hoped to increase the success of typing of the samples studied, reduce the number of amplification reactions, differentiate the species of Leptospira spp. in pathogenic, intermediate and saprophytic by mean only one reaction; Avoiding the expensive previous step of sequenciation in the case of pathogenic species and increasing the accessibility of the typification by cost and complexity reduction, even in relation to the best methodology available and currently applied. All this would increases the available information of the circulating species in Argentina at a lower cost, and with a simpler and more accessible technology, with less working and time consumption and less delay in obtaining the result. The analytical specificity and sensitivity and typing successes of each PCRs technique developed will be determined, by using of reference strains and a panel of sera and whole blood of patients from Argentina with confirmed and discarded leptospirosis.