Análisis de la inmunogenicidad de variantes O-glicosiladas del Inteferón alfa 2b y desarrollo de versiones con inmunogenicidad reducida

Abstract

El interferón alfa 2 humano recombinante (rhIFN-α2), agente antiviral empleado para el tratamiento de hepatitis B y C crónicas, es una citoquina de corta vida media en circulación. Esto constituye el principal factor responsable del fracaso de la terapia con rhIFN-α2 producido en bacterias, debido a los efectos tóxicos asociados a las elevadas dosis y frecuencia de administración requeridas. En nuestro laboratorio se han diseñado variantes del rhIFN-α2b de acción prolongada mediante su fusión a etiquetas peptídicas con diverso número de sitios potenciales de O-glicosilación. Una de ellas, GMOP-IFN, presenta perfil farmacocinético y actividad biológica mejorados con respecto a la citoquina original. No obstante, tratamientos prolongados con hIFN-α2 pueden dar lugar al desarrollo de anticuerpos anti-IFN que al unirse a la citoquina pueden alterar su farmacocinética o incluso inhibir su acción terapéutica. Este trabajo se centró en el análisis de la inmunogenicidad de GMOP-IFN y el desarrollo de variantes con inmunogenicidad reducida, sin impactar negativamente en su estructura y función biológica. Se aplicó un procedimiento de de-inmunización, empleando herramientas de predicción in silico para identificar aquellas regiones potencialmente inmunogénicas en GMOP-IFN, así como los cambios puntuales que conducirían a la reducción de su inmunogenicidad global, sin alterar su estructura y actividad biológica. Estas modificaciones fueron introducidas en cuatro variantes, dos de las cuales conservaron gran porcentaje de la actividad antiviral original. Ambas proteínas mantuvieron intactos los parámetros farmacocinéticos mejorados de GMOP-IFN con respecto a la citoquina comercial, exhibiendo además una inmunogenicidad ex vivo e in vivo inferior a la de la molécula original.

Recombinant human interferon alpha 2 (rhIFN-α2) is a cytokine with extremely short plasma half-life, commonly administrated for the treatment of chronic Hepatitis C an B patients. Its reduced residence time in serum is responsible for the failure of the therapy with rhIFN-α2 produced in bacteria, due to the toxic effects associated with high dosages and frequency of administration. In our laboratory different variants of rhIFN-α2b with improved pharmacokinetic profiles have been designed by fusing the cytokine sequence to O-glycosylated peptide tags. One of these, GMOP-IFN, has shown improved pharmacokinetic profile and biological activity with respect to the original cytokine. However, prolonged treatments with rhIFN-α2 may lead to the generation of anti-IFN antibodies, which could neutralize the therapeutic effect of the cytokine or partially reduce its action. For this, we focused on the analysis of GMOP-IFN immunogenicity and the development of new therapeutic candidates with reduced antigenicity/immunogenicity, without affecting its structure and biological function. In silico prediction tools allowed the identification of potentially immunogenic regions in the GMOP-IFN sequence, as well as those point mutations that could lead to a reduction in the overall immunogenicity, which were then integrated into four de-immunized variants. Two of these variants preserved the original antiviral function and showed null antiproliferative activity, an additional favorable characteristic when considering the dramatic hematologic disorders associated with this rhIFN-α biological function. Moreover, pharmacokinetic parameters for both variants were similar to those of GMOP-IFN. Finally, both muteins exhibited reduced ex vivo and in vivo immunogenicity when compared to the original molecule.