Efectos multigeneracionales del glifosato en la histofuncionalidad gonadal de ratas macho adultas

Abstract

Se define a un perturbador endocrino (PE) como “una sustancia o mezcla de sus-tancias exógenas que altera (n) alguna función del sistema endocrino y, en conse-cuencia, causa (n) efectos adversos sobre la salud de un organismo intacto, su pro-genie o subpoblaciones”. Entre los PE más estudiados se mencionan los plaguicidas, de uso domiciliario y agrícola, y entre estos últimos a los herbicidas a base de glifosato (HBG); por ser los de mayor uso y aplicación. Su principio activo, el glifosato, tiene baja persistencia en el ambiente, pero su impacto ambiental depende del grado y la frecuencia de aplicación. La exposición al herbicida puede ocurrir por la manipula-ción laboral directa, o por residir en la cercanía a las zonas de aplicación o por la in-gesta de agua o alimentos contaminados. Hay numerosa evidencia obtenida de estu-dios epidemiológicos y en animales de experimentación que sostiene que los PEs, están involucrados en la disminución de la fertilidad masculina. El estudio de los efec-tos de los HBG o el glifosato puro (GLI) sobre la histofuncionalidad testicular de roe-dores ha sido abordado utilizando distintos esquemas experimentales. Sin embargo, no hay un acuerdo general acerca de si es más nociva la exposición a GLI o a un HBG. Esta incertidumbre enfatiza la necesidad de contar con diseños experimentales que permitan distinguir entre los efectos causados por el principio activo (glifosato) de aquellos atribuibles a surfactantes y adyuvantes. Sumado a la necesidad de contar con experimentos que permitan estudiar distintas generaciones. En los últimos años optimizamos un modelo de exposición perinatal (durante la gestación y lactancia) que nos permite estudiar el impacto de los PE sobre la descendencia F1 (1° generación) y F2 (2° generación). Basándonos en los antecedentes y de acuerdo con nuestra expe-riencia hipotetizamos que: “la exposición a GLI o a un HBG induce efectos multigene-racionales afectando las características histológicas y la funcionalidad testicular de ratas adultas, que podrían comprometer la fertilidad de las mismas”. Plantemos como objetivo general “analizar el impacto de una dosis (considerada ambientalmente relevante) de GLI o HBG sobre la histología y la funcionalidad testicular, con énfasis en los efectos multigeneracionales” utilizando dos enfoques experimentales (in vivo e in vitro). A) Estudio in vivo: en los machos F2, descendencia de hembras F1 expuestas in utero y durante la lactancia a GLI o HBG planteamos: 1) evaluar la fertilidad me-diante un protocolo de cría continua; 2) determinar los niveles séricos de testosterona y E2; 3) evaluar la histología testicular, analizando la proporción de las distintas po-blaciones celulares; 4) cuantificar la proliferación de las células intratubulares y la ex-presión de receptores de hormonas esteroides en las mismas; diferenciando entre células germinales y células de Sertoli; 5) evaluar la integridad de la barrera hemato-testicular mediante el estudio de proteínas características de las células de Sertoli; 6) cuantificar la expresión de genes claves implicados en la integridad de la barrera he-mato-testicular; 7) analizar la viabilidad celular y los procesos de necrosis y apoptosis tisular mediante citometría de flujo. B) Estudio in vitro: utilizando un modelo de ex-posición in vitro sobre la descendencia F1, planteamos como objetivo específico 8) establecer los efectos de GLI o HBG sobre el desarrollo temprano de células germina-les en cultivos de testículos enteros.

An endocrine disruptor (ED) is defined as "an exogenous substance or mixture of substances that alter(s) some function of the endocrine system and consequently causes adverse health effects in an intact organism, its progeny or subpopulations". Among the most studied EDs are household and agricultural pesticides, and among the latter, glyphosate based herbicides (GBHs), as they are the most widely used and applied. Their active ingredient, glyphosate, is poorly persistent in the environment, but their environmental impact depends on the extent and frequency of application. Exposure to the herbicide can occur through direct occupational handling, by living near application areas, or by ingesting contaminated food or water. There is sufficient epidemiological and experimental evidence to suggest that EDs are involved in reducing male fertility. The effects of GBHs or pure glyphosate (GLI) on rodent testicular histofunction have been studied using different experimental designs. However, there is no general agreement as to whether exposure to GLI or GBH is more harmful. This uncertainty highlights the need for experimental designs that distinguish between effects caused by the active ingredient (glyphosate) and those caused by surfactants and In addition, there is a need for experiments to study different generations. In recent years, we have optimized a perinatal exposure model (during gestation and lactation) that allows us to study the effects of EDs on F1 (1st generation) and F2 (2nd generation) offspring. Based on the background and our experience, we hypothesized that “exposure to GLI or a GBH induces multigenerational effects affecting histological characteristics and testicular functionality in adult rats, which could affect their fertility”. Our general objective is to "analyze the impact of a dose (considered environmentally relevant) of GLI or HBG on testicular histology and functionality, with emphasis on multigenerational effects" using two experimental approaches (in vivo and in vitro). A) In vivo study: in F2 males, offspring of F1 females exposed in utero and during lactation to GLI or HBG, we propose to 1) assess fertility using a continuous breeding protocol; 2) determine serum testosterone and E2 levels; 3) assess testicular histology, analyzing the proportion of different cell populations; 4) quantify intratubular cell proliferation and steroid hormone receptor expression in the cells; differentiate between germ cells and Sertoli cells; 5) assess the integrity of the blood testicular barrier by studying proteins characteristic of Sertoli cells; 6) quantify the expression of key genes involved in the integrity of the blood testicular barrier; 7) analyze cell viability and the processes of tissue necros is and apoptosis by flow cytometry. B) In vitro study: u sing an in vitro exposure model on F1 offspring, our specific aim is to 8) determine the effects of GLI or HBG on early germ cell development in whole testis cultures.