Obtención de protoplastos en hongos Agaricomycetes para aplicaciones biotecnológicas

Abstract

El presente trabajo tuvo como objetivo desarrollar y optimizar un protocolo eficiente para la obtención de protoplastos viables a partir de micelio de hongos Agaricomycetes. Estos protoplastos representan herramientas útiles para estudios de fusión celular, generación de híbridos, transformación genética e investigaciones aplicadas en biotecnología. Se trabajó con cepas de Ganoderma sessile y Pleurotus ostreatus, confirmando su identidad mediante secuenciación de la región ITS. Se obtuvieron y caracterizaron cultivos monospóricos, evaluando velocidad de crecimiento y realizando ensayos de cruzamiento. La obtención de protoplastos se realizó mediante un formulado enzimático comercial, ajustando condiciones de lisis y regeneración micelial en medios osmóticamente estabilizados. En P. ostreatus se logró un protocolo con altos niveles de regeneración, mientras que en G. sessile se evaluó además la eficiencia regenerativa. Se realizaron ensayos de sensibilidad antifúngica frente a Carboxina, y se llevaron a cabo pruebas preliminares de transformación genética de protoplastos utilizando plásmidos con genes reporteros y vectores de selección, empleando metodologías que incluyen tanto PEG como electroporación. Los resultados obtenidos permitieron establecer protocolos adaptados a cada especie, evidenciando que la edad del micelio, la composición enzimática y las condiciones osmóticas son factores determinantes para la eficiencia en la obtención y regeneración de protoplastos. En conclusión, este trabajo sienta bases metodológicas para el desarrollo de futuras estrategias de manipulación genética y optimización de cepas fúngicas con potencial aplicación en la biotecnología, la industria y la producción de biomateriales.

The present work aimed to develop and optimize an efficient protocol for obtaining viable protoplasts from mycelium of Agaricomycetes fungi. These protoplasts represent useful tools for studies of cell fusion, hybrid generation, genetic transformation, and biotechnological applications. Strains of Ganoderma sessile and Pleurotus ostreatus were used, confirming their identity through sequencing of the ITS region. Monosporic cultures were obtained and characterized, evaluating growth rate and performing crossing assays. Protoplasts were obtained using a commercial enzymatic formulation, adjusting lysis and mycelial regeneration conditions in osmotically stabilized media. In P. ostreatus, a protocol with high regeneration levels was achieved, while in G. sessile the regenerative efficiency was also evaluated. Antifungal sensitivity assays against carboxin were performed, and preliminary genetic transformation tests of fungal protoplasts were carried out using plasmids containing reporter genes and selection vectors, employing both PEG and electroporation methodologies. The results obtained allowed the establishment of protocols adapted to each species, showing that mycelial age, enzymatic composition, and osmotic conditions are key factors determining efficiency in the obtention and regeneration of protoplasts. In conclusion, this work provides methodological bases for the development of future strategies in genetic manipulation and fungal strain optimization, with potential applications in biotechnology, industry, and biomaterial production.